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干货分享 | 细胞冻存及复苏避坑指南!
人阅读 发布时间:2024-04-16 17:56
细胞培养是生命科学实验中离不开的实验之一,它有广泛的应用。细胞培养可以用于研究细胞的信号转导、合成代谢、生长增殖等。细胞培养的常见实验包括细胞复苏、细胞传代和细胞冻存等,其中细胞冻存及复苏的过程对于细胞生长状态有重要影响。
01细胞冻存细胞冻存的目的是为了减少细胞代谢,液氮(-196℃)冻存是常用的细胞冻存方法,细胞冻存时应遵循基本原则:控制降温速率,要缓慢冻存。细胞冻存时,若不加入保护剂直接冻存,会对细胞造成严重损伤。如:局部电解质浓度改变,pH值改变,部分蛋白质变性;
细胞内冰晶形成,可引起溶酶体的损伤使溶解酶释放,造成细胞内结构成分的破坏、线粒体肿胀、功能丧失并造成细胞能量代谢障碍;
细胞膜上的类脂蛋白复合体在冷冻中易发生破坏引起膜通透性改变,使细胞内容物丧失;
细胞核在冷冻保存时也易受损。
为了降低在细胞冻存时对细胞的损伤,可以在冻存时加入冻存保护剂甘油或二甲基亚砜(DMSO)(SKU:02196055)以降低对细胞损伤或死亡。DMSO作为渗透性细胞保护剂,其能够迅速穿透细胞膜进入细胞中,防止细胞内液冰晶的形成,以及防止细胞结构紊乱等。
二甲基亚砜(DMSO)结构式
研究表明,不同浓度的DMSO对细胞活力均有影响,DMSO浓度不超过10%时,对细胞的活力影响较小(如图1)。除此之外,DMSO浓度为10%时,抑菌效果能够接近100%。在DMSO中加入适宜浓度的血清,有助于解冻后提高细胞收获率和其功能活性的恢复。因此,细胞冻存时常常使用10%浓度的DMSO,可以在其中加入胎牛血清等作为保护剂,血清有助于解冻后细胞功能活性的恢复(如图2为细胞冻存流程图)。
图1. DMSO浓度与细胞活力[1]
图2. 细胞冻存操作流程图
细胞冻存注意事项1. 应选择生长状况良好的细胞进行冻存;2. 冻存时细胞密度不能太低,推荐密度为100-300万细胞/mL;3. 冻存液中DMSO对细胞有所损伤,冻存过程要快,加入细胞冻存液后尽快进入降温程序;4. 不能将细胞悬液直接放在超低温下快速冷冻;5. DMSO属于致癌物质,使用时应戴好手套,规范操作。02细胞复苏细胞复苏是指将冻存在液氮或低温冰箱中的细胞解冻后重新培养,使其恢复生长的过程。细胞复苏过程中,需要遵循快速融化的原则,这样可以保证细胞外结晶短时间内融化,避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内再形成冰晶对细胞造成损伤。细胞复苏后1-2天,细胞活性会逐渐得到恢复(如图3为复苏HEK293T细胞数对数值)。
细胞复苏的主要实验过程如下:
步骤1:从液氮容器或低温冰箱中取出冻存管,迅速将其浸入37℃的温水中,并不时摇动以使其尽快融化。37℃水浴时间尽可能短(1-2min),因为延长时间会增加细胞死亡率;
步骤2:当细胞完全融化后,从水浴中取出冻存管,用酒精棉球消毒外部,然后开启瓶盖;
步骤3:将细胞悬液转移到离心管中,加入适量的培养液,并进行离心,以去除DMSO和死细胞;
步骤4:离心后,弃去上清液,用新的培养液重悬细胞,并计数,调整细胞密度;
步骤5:将细胞接种到培养瓶中, 37℃静置培养。在培养初期,应注意观察细胞状态,以确保其正常生长。
图3. HEK-293T细胞生长曲线(复苏后)[2]
图4. 细胞复苏操作流程图
细胞复苏注意事项1. 注意无菌操作,避免细胞污染,可使用支原体去除喷雾剂(SKU:093050853)提前对实验室环境,培养箱进行处理;2. 融化细胞时,温度和时间应严格控制,以避免对细胞造成损伤;3. 在细胞接种后,应定期观察细胞生长情况,疑似支原体污染时可使用可视化LAMP支原体检测试剂盒(SKU:0930506)检测,若发生支原体污染,可使用支原体去除试剂(SKU:0930500)及时处理。03总结
细胞冻存及复苏是细胞培养常见的实验方法,选择合适的方法以及合理的操作能够保证细胞的活性。除此之外,选择合适的冻存保护剂也是该实验中较为关键的一步,例如DMSO应当选择内毒素水平低、细胞培养级的产品,能够降低对细胞的损伤。
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参考文献:
[1] Addison CJ, Chu SH, Reusch RN. Polyhydroxybutyrate-enhanced transformation of log-phase Escherichia coli. Biotechniques. 2004 Sep;37(3):376-8, 380, 382. doi: 10.2144/04373ST01. PMID: 15470891.
[2] 杨彪,梅晰凡,刘福强.HEK-293细胞复苏培养及冻存[J].辽宁医学院学报,2007,(06):1-3.